診斷弓形蟲病依靠血清學檢查。在疾病的最初2周出現特異性IgM抗體，在4~8周內出現高峯，然後在數月內下降直至測不到。IgG抗體上升較緩慢，1~2個月後達高峯，並可在穩定的高水平上持續數月至數年。
出現IgM抗體或IgG升至4倍，常表明爲急性感染。若淋巴結腫大的孕婦或免疫受損腦炎病人的IgG免疫熒光試驗或染色試驗的滴度>1：1000陽性，也應懷疑急性感染。能防止再感染的過去的感染，其典型的血清學結果是IgG陽性而IgM陰性。
新生兒疾病時測到特異性IgM抗體表明爲先天性感染(母親的IgG能通過胎盤而IgM不能)。活動性脈絡膜視網膜炎時，可測到低滴度的IgG抗體但不能測到特異性IgM。
血清學對診斷艾滋病者的弓形蟲病幫助不大，在重新激活時不出現IgM抗體，而抗弓形蟲IgG抗體不能區別隱性感染還是再激活的感染。在美國，艾滋病患者不論是否存在有臨牀症狀的弓形蟲病，他們的IgG陽性率爲20%~30%。
用急性期的活檢材料或體液接種小鼠或組織培養可分離得到弓形蟲，但該法需要6個星期的時間。組織學檢查也可發現蟲體，急性感染時的速殖子用吉姆薩或賴特染色效果很好，但常規的組織切片染色很難找到蟲體。
組織包囊不能區別急性和慢性感染。弓形蟲還必須與組織胞漿菌，克氏錐蟲和利什曼原蟲等其他細胞內病原體區別。快速測定血液，腦脊液和羊水中的弓形蟲抗原或經PCR擴增的DNA的診斷試驗尚在研究中。用PCR技術分析羊水似乎是診斷胎內弓形蟲病最敏感的方法。
中樞神經系統弓形蟲病時，腦脊液中淋巴細胞增多，蛋白含量增加。典型的CT掃描可見多發性緻密的圓形病變，使用對比劑時可形成環狀增強的病變。磁共振比CT更敏感。
雖然這些病變無診斷特徵性，但艾滋病伴中樞神經系統症狀的病人出現這種CT或磁共振影像變化可作爲施行經驗治療的依據。若弓形蟲病的可疑診斷是正確的，則7~14日內臨牀及放射學均可獲明顯改善。對艾滋病患者的中樞神經系統弓形蟲病的特異性診斷需求助於腦活檢。
